Dna_Vaccine

DNA疫苗佐剂研究进展 作者： 作者单位： 刊名： 英文刊名： 年，卷(期)： 被引用次数： 张天笑， 王秀利， 袁野， Zhang Tianxiao， Wang Xiuli， Yuan Ye 大连水产学院生命科学与技术学院,大连,116023 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2007，""(5) 0次 参考文献(40条) 1.Rabinovich　NR.McInnes　Klein 查看详情 1994 2.Wolff JA 查看详情 1990 3.Tang DC.Deivit M.Johnston SA 查看详情 1992 4.Ulmer JB 查看详情 1993 5.Nucleic Acid Vaccines WHO Geneva 查看详情 1994 6.李忠明 当代新疫苗 2001 7.崔保安 查看详情[期刊论文]-生物工程学报 2006(03) 8.邹丽容.陈则 查看详情[期刊论文]-激光生物学报 2002(05) 9.SNGHM　O'HAGAND 查看详情 1999(11) 10.侯俊玲 查看详情[期刊论文]-中国兽医科技 2005(02) 11.宴菊芳 查看详情 2000(04) 12.李文波 查看详情[期刊论文]-免疫学杂志 2001(01) 13.于涟 查看详情 2001(16) 14.Deo G.Bellobuono A 查看详情 2002(11) 15.Wong HT 查看详情 2002(21-22) 16.Kim JJ 查看详情 2001 17.Katae M 查看详情 2002(09) 18.董德神.李琦涵 疫苗技术基础与应用 19.Heath WR.Carbone FR 查看详情 2001 20.Guo H 查看详情[期刊论文]-Chinese Medical Journal(Engl) 2001(03) 21.Min W.Lillehoja HS 查看详情 2001 22.Qin JT 查看详情 2007(02) 23.Sun X 查看详情 2002(9-10) 24.OV-YANGP 查看详情 2002(03) 25.陈颖.项黎新.邵健忠 查看详情[期刊论文]-细胞生物学杂志 2006 26.Kojima Y.Xin KQ.Ooki T 查看详情 2002 27.Arrington J.Braun RP 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淋巴细胞中各细胞亚群的比例,表明DNA疫苗pAdTrack-ORF2和pAdTrack-ORF1+2 DNA疫苗免疫可以引起小鼠脾脏淋巴细胞中Th(CD3+CD4+CD8-)亚群和 Tc(CD3+CD4-CD8+)亚群的相对含量增加,佐剂包被的DNA疫苗免疫效果更为显著,两种佐剂之间没有显著差异.试验表明，DNA疫苗pAdTrack-ORF2和 pAdTrack-ORF1+2DNA疫苗通过肌肉接种均能够诱导小鼠产生特异性抗体反应,引起NK细胞杀伤活性和脾淋巴细胞增殖反应加强以及脾脏淋巴细胞T细胞亚 群增加,壳聚糖和脂质体作为佐剂可以提高免疫效果. 2.学位论文 赵武 猪繁殖与呼吸综合征双基因及佐剂活病毒载体疫苗与DNA疫苗研究 2005 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传 染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世界各主要养猪国家与地区，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。同其它多数病毒病的 防制一样，免疫接种仍是预防与控制PRRS的主要措施。目前用于预防PRRS的主要商用疫苗是传统常规疫苗弱毒疫苗和灭活疫苗。但已证实弱毒苗存在散 毒及高几率毒力返强的安全隐患，国外许多国家已禁用弱毒苗。灭活苗尽管安全性较好，但不仅需多次重复接种，而且免疫效果不理想，还经常可导致 免疫失败。因此，迫切需要更安全、高效、廉价的新型疫苗来预防和控制PRRS的发生与流行。 蛋白转导是新近发展和建立起来的一种富有生命力的新技术。其高效的跨膜转运功能和在细胞间自主传递的特点，为提高新型疫苗免疫效应提供了 新的思路和有效手段。目前已证实具有独特蛋白转导特性的来源于a-疱疹病毒亚科的VP22同源物，能显著提高与之融合的外源蛋白的递呈效率进而提高 其免疫原性，并证实可显著提高DNA疫苗或腺病毒载体疫苗的免疫效应，其中牛疱疹病毒1型(BHV-1)VP22是极具开发应用潜力的新型高效的蛋白转导免疫 增强佐剂分子。 鉴于此，本研究以PRRSV两个最主要的保护性抗原基因…经修饰具有更好免疫原性的ORF5基因(ORF5M)以及ORF6基因为靶基因，以BHV-1 VP22为免疫 增强佐剂分子，开展了以伪狂犬病毒(PRV)为载体的PRRS双基因及佐剂活病毒载体疫苗以及PRRS双基因及佐剂DNA疫苗研究，主要研究内容如下： 1、双基因及佐剂重组伪狂犬病毒TK／gE／VP22E／VP22M的构建与免疫反应 采用PCR方法从含：BHV-1 VP22基因及PRRSV ORFSM基因的质粒中，扩增到不含终止子的VP22基因以及ORF5M基因的完整编码区，并进行了克隆和序列 分析，经序列测定证实两基因均未发生碱基突变。将ORF5M及VP22基因依次插入到PRV通用转移载体pIECMV中，构建了含VP22-ORF5M融合基因的PRV转移质 粒plECMV-VP220RF5M。再将与VP22基因融合的PRRSV ORF6基因表达盒插入到plECMV-VP220RF5M中，构建了含VP22-ORF5M与VP22-ORF6融合基因的PRV转移 质粒pIECMV-VP220RF5M-VP220RF6。采用脂质体介导法将转移质粒与EcoRI线性化后的PRV gE基因缺失标记疫苗株TK／gE／LacZ基因组共转 染IBRS-2细胞，出现细胞病变(CPE)的转染产物经蚀斑纯化结合PCR扩增筛选，构建了融合表达VP22与ORF5M基因的单基因及佐剂重组伪狂犬病毒 (rPRV)TK／gE／VP22E，以及共表达与VP22融合的ORF5M与ORF6基因的双基因及佐剂rPRVTK／gE／VP22E／VP22M，并经 ：PCR、Southern blot、Western blot、IFA证实构建正确，外源融合基因得到表达，并具有免疫学活性。而且外源基因的插入不影响rPRV在IBRS-2或 PK-15细胞上的增殖。 2、PRRS双基因及佐剂DNA疫苗pCI-VP22ORF5M-VP22ORF6的构建与免疫反应 将BHV-1 VP22基因以及PRRSV ORF5M基因依次插入到真核表达载体pCI-neo中，构建了融合表达VP22与ORF5M基因的单基因及佐剂DNA疫苗表达质粒 pCI-VP22ORFSM。再将VP22-ORF6融合基因表达盒插入到pCI-VP22ORF5M中，构建了共表达与VP22融合的ORF5M及ORF6基因的双基因及佐剂DNA疫苗表达质粒 pCI-VP22ORF5M-VP22ORF6，经IFA和Western blot证实，外源融合基因得到表达，并具有免疫学活性。将单/双基因及佐剂DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，并与 单/双基因DNA疫苗pCI-ORF5M与pCI-ORF5M-ORF6进行比较。结果显示，4种DNA疫苗诱导体液及细胞免疫反应的能力从低到高顺序均为：单基因DNA疫苗 ＜单基因及佐剂DNA疫苗＜双基因DNA疫苗＜双基因及佐剂DNA疫苗。其中，单基因及佐剂DNA疫苗诱导的ELISA抗体、中和抗体水平与淋巴细胞增殖反应与 相应的单基因DNA疫苗相比差异均显著。较之于单基因DNA疫苗，双基因及佐剂DNA疫苗诱导的ELISA抗体和中和抗体均比双基因DNA疫苗更为显著。而且双 基因及佐剂DNA疫苗诱导的淋巴细胞增殖反应与相应的双基因DNA疫苗相比差异显著。表明双基因及佐剂DNA疫苗具有最佳的免疫效应，而且能诱导更强的 细胞免疫反应，VP22有效发挥了基因免疫佐剂效应。这为研制更为有效的PRRS的DNA疫苗奠定了基础，也为其它疾病的高效新型疫苗研究提供了思路。 3.期刊论文 郑秀惠.梁培禾.李力.ZHENG Xiu-hui.LIANG Pei-he.LI Li 分子佐剂在DNA疫苗中的应用 -国际生殖健 康/计划生育杂志2009,28(3) 如何增强和提高DNA疫苗的免疫效果是新一代DNA疫苗分子设计和研究的关键问题,其中之一就是应用分子佐剂来优化DNA疫苗.分子佐剂可将以基因方 式传递的免疫刺激分子与DNA疫苗共免疫,在体内表达相应的蛋白,增强T、B细胞对疫苗成分的体液及细胞免疫应答.目前研究较多的分子佐剂有:细胞因子 如干扰素(IFN)、白细胞介素2(IL-2)、IL-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等;共刺激分子如B7-2、CD40L等;补体佐剂如C3;免疫刺激序列如 CpG、寡核苷酸(ODN)等.分子佐剂在体内与疫苗基因共表达,改善抗原的周边微环境,提高疫苗的免疫效果.因此,分子佐剂是目前DNA疫苗研究中的热点问 题之一. 4.学位论文 李鼎锋 体内电穿孔递送途径在DNA疫苗中的应用以及DNA疫苗载体转录产生的dsRNA的佐剂效应研究 2006 DNA疫苗是一种很有希望的新型疫苗策略。如何大幅度提高DNA疫苗的免疫原性是其发展所面临的首要问题，如何把质粒DNA高效率导入宿主细胞以及 如何实现抗原蛋白的高效率呈递是DNA疫苗的两个关键环节。 首先，本论文应用体内电穿孔技术增强DNA疫苗的递送效率。我们构建了荧光素酶(Luciferase)表达质粒p1.0-luc，将其通过直接肌肉注射、肌注后 以双针电极进行电穿孔、肌注后以钳式电极进行电穿孔等三种不同方法注射小鼠，72小时后取注射部位的肌肉测定Luciferase的表达情况。同时构建携 带密码子优化的HIV-1B'/C重组亚型CN54株gag基因的DNA疫苗质粒p1.0-gag，在10μg、100μg两个剂量水平上通过以上三种不同的方法免疫Balb/c雌性 小鼠，EUSA方法检测Gag特异的抗体反应，ELISPOT方法和细胞内因子染色技术检测细胞免疫应答。结果表明应用体内电穿孔技术可以使Luciferase在小 鼠肌肉中的表达水平显著提高(最高达到66倍)，并增强了Gag特异的体液免疫应答(最高达到28倍)，显示了体内电穿孔技术在DNA疫苗递送方面的良好作 用，其中使用双针电极的效果要显著好于钳式电极。同时，研究表明体内电穿孔对于Gag特异的细胞免疫应答并没有显著影响。 其次，本论文创造性地构建了能够在抗原表达细胞内转录产生双链RNA(dsRNA)分子的新型DNA疫苗载体，探索dsRNA分子对DNA疫苗的佐剂效果。我们 构建了一双表达盒的DNA质粒pDRVI3.1，并克隆入3个含回文结构的DNA片段(包括正义链-茎环序列-反义链)，获得质粒pDS40、pDS200及pDS750，通过在 细胞内的转录，可分别形成长度为40bp、200bp和750bp的dsRNA分子(含9nt或12nt的环)。我们利用上述载体分别构建了携带luciferase基因、HIV1env基因、HIV-1 nef基因的重组质粒。体内外基因表达和细胞凋亡检测结果表明，长的750bp dsRNA分子能够显著抑制外源基因表达并诱导细胞的凋亡 。小鼠免疫结果表明，在相同的免疫剂量和免疫次数下，携带短的40bp dsRNA：表达盒的DNA疫苗所诱导的特异性细胞免疫反应显著高于传统DNA疫苗所 诱导的反应水平(最高达到4倍)；在低1个数量级的质粒剂量或少1次免疫注射的情况下，携带短的40bp dsRNA表达盒的DNA疫苗能够诱导出与传统DNA疫苗 相同水平的细胞免疫应答；而携带750bp dsRNA表达盒的质粒不能增强细胞免疫应答。同时，dsRNA表达盒在诱导体液免疫应答方面不具备优势，甚至降 低了体液免疫应答水平。 综合以上两部分的结果，体内电穿孔作为一种新的基因递送途径能够显著增强目的基因表达水平和抗原特异的体液免疫反应；而携带短的dsRNA表达 盒的新型DNA疫苗载体能够显著增强抗原特异的细胞免疫应答。 5.期刊论文 项伟.赵玉军.XIANG W.ZHAO YJ DNA疫苗佐剂研究进展 -中国兽药杂志2007,41(1) 本文综述了具有载体功能佐剂:脂质体,免疫刺激复合物,减毒的侵袭性胞内细菌和免疫激活作用的佐剂:CpG寡核苷酸免疫调节序列,细胞因子,趋化因 子,在DNA疫苗中应用的佐剂机理,相应的优缺点,佐剂应用及现状. 6.学位论文 孙静 DNA疫苗载体优化设计和新型佐剂的研究 2009 DNA疫苗作为一种新型疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势，同时能诱导体液免疫和细胞免疫，而且抗原编码的“裸”DNA具有相对安全、稳定、生 产方便和在体内能介导抗原的长期表达等优点。但是由于免疫原性相对较弱，目前DNA疫苗的发展仍然受到很大的限制。 提高抗原基因的表达对提高DNA疫苗的免疫原性起到重要的作用，抗原基因的优化策略包括：对质粒载体骨架调控元件的优化和利用宿主基因的偏好 对密码子进行优化等。目前常利用人巨细胞病毒(hCMV)第一内含子(IntronA)作为转录后调节元件，与hCMV启动子/增强子(Promoter/Enhancer)一同提高 缺失内含子的目的基因的表达。有文献报道，乙肝病毒(HBV)/旱獭肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(H/WPRE)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)组成性转运元件 (CTE)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)pre—mRNA加工增强元件(PPE)都能通过提高mRNA的稳定性、3’末端的加工、促进mRNA出细胞核和细胞质中 mRNA的积累来增强未经剪接的基因表达。但是这类转录后调节元件是否能替代hCMVintronA或与其产生协同作用，从而提高DNA疫苗免疫原性还有待进行 研究。 本研究首先通过删除pVR1012质粒载体hCMVIE intronA，构建内含子缺失的质粒载体pCMV，然后将HPRE、WPRE、CTE、PPE元件分别克隆入pVR1012和 pCMV，获得了pIn—HPRE、pIn—WPRE、pIn—CTE、pIn-PPE和pHPRE、pWPRE、pCTE、pPPE载体。为比较hCMV IE intronA与HPRE、WPRE、CTE、PPE元件对 目的基因表达的调控，将luciferase报告基因分别克隆入上述载体，体外瞬时转染293T细胞。实验结果表明，与pVR1012载体相比pIn—HPRE和 pIn—WPRE能显著增强体外luciferase基因的表达，而pHPRE、pWPRE与pVR1012无差别。为比较HPRE、WPRE元件在hCMV IE intronA存在和缺失的情况下 ，对体外抗原基因表达及体内抗原特异的免疫反应增强效果的差异，将野生型或密码子优化型的HIV—1B’/C重组亚型CN54株Gag基因克隆入携带HPRE、 WPRE元件的pVR1012和pCMV的载体，体外瞬时转染293T细胞和免疫Balb/C小鼠进行比较。实验结果表明，PRE元件能够显著地提高野生型Gag基因在293T细 胞中的表达，其中当hCMV IE intronA和HPRE元件在载体上同时出现的时候基因的表达水平最高，而且pInHGagw(+intronA/+HPRE)在10μg剂量诱导出的 免疫反应水平高于pGagw(—intronA/—HPRE)以及pInGagw(+intronA/—HPRE)在40μg剂量所诱导的水平。虽然载体优化对提高体外和体内密码子优化型 抗原基因表达作用不太明显，但研究结果发现：如果载体经hCMVIE intronA和HPRE元件的优化，那么即使携带野生型基因的载体也能达到与等量的密码 子优化GagDNA疫苗体外抗原基因表达和体内免疫原性相同的水平。 大量的实验证明佐剂能够增强DNA疫苗的免疫原性。卡介菌的细胞壁骨架由分支菌酸、阿拉伯半乳糖、肽聚糖组成，能激活至少五种Toll样受体 (TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR9)，同时BCG中富含有免疫调节作用的CpG基序，因此它被认为是强有效的非特异免疫刺激剂，并在许多疫苗研究中得以 使用。卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)是经热酚法提取卡介菌多糖核酸制成的免疫调节剂，在临床上已经被成功地运用于免疫失调或免疫水平下降及过敏性疾 病的治疗。本研究选择卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)作为佐剂，评价了在不同剂量、不同免疫次数下BCG-PSN对pDRVI1.0gp1455M(HIV—1 CN54 gp145基因 )DNA疫苗诱导的体液免疫，细胞免疫以及长期免疫记忆的增强作用。实验结果表明，BCG-PSN和DNA疫苗质粒混合后注射，能显著地提高DNA疫苗的免疫原 性。并且BCG-PSN的使用能够减少DNA疫苗的免疫次数，降低DNA疫苗的用量。 本研究为提高DNA疫苗免疫原性提供了新的途经，为开发中国株HIV—1DNA疫苗奠定了坚实的基础。 7.期刊论文 张文卿 基因佐剂在DNA 疫苗中的应用 -国外医学（免疫学分册）2004,27(6) 基因佐剂可将编码某些具有佐剂作用成分的基因与DNA疫苗共免疫,在体内表达相应的蛋白,增强T、B细胞对疫苗成份的体液及细胞免疫应答.目前研 究较多的基因佐剂有:细胞因子基因佐剂如IL-12、IL-2、IFN-γ、GM-CSF等;共刺激分子基因佐剂如 B7-2、CD40L 等;免疫刺激DNA序列基因佐剂如CpG、 ODN 等.基因佐剂在体内与疫苗基因共表达,改善抗原的周边微环境,提高疫苗的免疫效果.因此,基因佐剂是目前DNA疫苗研究中的热点问题之一. 8.学位论文 王静 重组LTB蛋白的高效表达、纯化及其对HPV16L1 DNA疫苗的佐剂效应 2003 大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)是迄今为止已知的最有前途的粘膜免疫佐剂之一,可辅佐外来抗原产生有效的粘膜和系统免疫.同时,LTB又有 显著的免疫调节活性,因此近年来有关LTB的高效制备、免疫生物学以及粘膜佐剂应用的研究颇受关注.人乳头瘤病毒(HPV)是能引起人类皮肤粘膜增生性 病变的一类DNA肿瘤病毒,其中某些高危型(包括HPV16和HPV18)是人类绝大部分(80％)子宫颈癌的重要启动因子.子宫颈癌主要危害经济不发达落后地区的 广大妇女,中国每年死于子宫颈癌的妇女总数约占全世界因子宫颈癌死亡者的几近半数,因此在中国进行预防性HPV16疫苗研究具有重大的意义.HPV16主要 引起尿生殖区感染,主要侵袭人体的肛—生殖道粘膜.因此,理想的预防性HPV16疫苗必须能在粘膜部位激发高水平的保护性抗体.众所周知,通常,抗原经粘 膜途径进入机体不能激发有效的免疫反应,相反,往往引起免疫耐受,必须辅以适当的粘膜佐剂始能克服.所以,开发有效的粘膜佐剂,对研制预防性HPV16疫 苗已是当务之急.目的:(1)建立一套高效表达、纯化重组大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(rLTB)的方法,并对其免疫学活性进行研究.(2)研究rLTB在 HPV16 DNA疫苗中的佐剂效应,为制备可明显增强阴道粘膜免疫的新型HPV预防性疫苗奠定基础.结论:(1)通过对rLTB蛋白表达和纯化过程的优化,建立了一 套简便、高效、易行的制备rLTB蛋白的方法.该方法的建立为大规模制备rLTB蛋白奠定了基础.(2)证实了该方法制备的rLTB蛋白一方面具有粘膜佐剂活性 ,经鼻粘膜免疫后,可显著增强机体对共免疫抗原的系统和粘膜反应;另一方面,rLTB蛋白在体外具有免疫抑制作用.rLTB蛋白的这两种免疫学作用将为其应 用于新型粘膜疫苗的研制及修饰异常免疫反应提供依掘.(3)首次利用LTB蛋白作为HPV16 DNA疫苗的佐剂,并对不同免疫途径的免疫效果进行了分析.证实 LTB对于HPV16L1 DNA疫苗的佐剂效应与其免疫的途径有关.经肌肉注射免疫,LTB可增强其系统体液免疫应答,但对细胞免疫则无增强作用,也不能产生有效 的粘膜免疫,而且证实了LTB可使免疫反应向Th2型极化.(4)证实经鼻滴入和口服免疫,LTB可增强HPV16L1 DNA疫苗的体液和细胞免疫,而且可刺激机体粘膜 淋巴组织分泌HPV16L1特异性IgA,从而产生有效的粘膜免疫应答,这将有助于对HPV16这种以性传播为主要感染途径的疾病的预防,将为开发有效预防 HPV16感染、子宫颈癌及相关肿瘤的疫苗奠定基础. 9.期刊论文 刘强.靳津.邹强.张硕.丁崝.许寒茜.马志博.张通.王宾.LIU Qiang.JIN Jin.ZOU Qiang.ZHANG Shuo. DING Zheng.XU Han-qian.MA Zhi-bo.ZHANG Tong.WANG Bin IL-17作为分子佐剂增强HIV DNA疫苗细胞免疫应答的 研究 -中华微生物学和免疫学杂志2010,30(3) 目的 为了进一步增强HIV DNA疫苗的免疫反应,本研究将IL-17作为HIV DNA疫苗的分子佐剂免疫小鼠,旨在探讨IL-17对HIVDNA疫苗诱导体液和细胞免 疫应答的影响.方法 将小鼠IL-17构建到真核表达载体,与HW-1膜蛋白DNA疫苗pGX-Env联合免疫BALB/c小鼠;分别在第0、2周进行免疫,在第4周检测T淋巴 细胞增殖指数、抗-Env IgG、细胞因子表达水平和体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL)等免疫学指标.结果 IL-17能够增强HIV DNA疫苗的特定免疫反 应.与单注射疫苗组相比,IL-17作为佐剂组的T细胞增殖、抗体水平和CD4~+T细胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-17的表达均无明显增强,但对CD8~+T细胞分泌 IFN-γ的表达和体内CTL的效果影响明显(P